ЛАБОРАТОРИЯ
"БИОФОТОНИКА"

ПРОЕКТ: КП06/КОСТ/16

„Идентифициране на диагностично значими биомаркери в слъзната течност чрез оптични методи“

Процедура за предоставяне на национално съфинансиране за участие на български колективи в утвърдени акции по Европейската програма за сътрудничество в областта на научните изследвания и технологии COST

---

Ръководител на българския екип:  гл. ас. д-р Александра Желязкова

---

Слъзната течност е обещаващ неинвазивен източник на диагностична информация. Естествено съдържа протеини, липиди, метаболити, електролити и други молекули, които могат да отразяват както офталмологични, така и системни заболявания. Получаването на слъзна течност за изследвания не изисква инвазивна намеса и същевременно позволява детекцията на диагностично значими биомаркери.

Един от най-обещаващите оптични методи за диагностика е флуоресцентната спектроскопия, тъй като голяма част от компонентите на слъзната течност притежават автофлуоресцентни свойства и възникнали промени, свързани с дадено заболяване, в протеиновия състав, оксидативния стрес и метаболитното състояние се отразяват в интензитета и формата на флуоресцентните им спектри. В допълнение приложението на синхронна флуоресцентна спектроскопия позволява по-добра разделителна способност и идентифициране на флуоресцентните максимуми в биологични образци с множество флуорофори, като сълзите. На практика, този метод позволява да се разграничат припокриващи се флуоресцентни максимуми и да се дефинират по-добре спектрални изменения с биохимичен произход. Проектът цели идентифициране на диагностично значими биомаркери в слъзна течност получени чрез оптични методи. Екипът по проекта има богат опит в приложението на флуоресцентни техники, включително за анализ на биологични образци и идентифициране на диагностично значими оптични биомаркери, който ще бъде използван в предстоящите изследвания на слъзна течност.

Допълващ подход е Рамановата спектроскопия, която дава възможност за получаване на молекулен „отпечатък“ и детайлен биохимичен състав на слъзната течност. В допълнение, методът не изисква предварителна подготовка на образците, наблюдаваните ефекти от водните молекули са пренебрежими в сравнение с други техники, което е от полза, тъй като сълзите са воден биофлуид.

Други оптични методи, в чието приложение за изследване на биологични образци колективът има дългогодишен опит, са поляриметрия, флуоресцентна и поляризационна микроскопия. Ползите от тяхното приложение в изследването и анализът на слъзна течност за диагностично значими биомаркери ще бъдат идентифицирани в рамките на проекта.

Основното ограничение за прилагането на оптичните методи за анализ на слъзна течност не е аналитичният им потенциал, а клиничното внедряване. Преди рутинната им употреба в клинична среда са необходими изготвянето на протоколи за възпроизводимо събиране на слъзна течност, стандартизирана предварителна подготовка и надежден анализ. Обуславя се необходимостта от натрупване на база данни за чести и значими заболявания. Въпреки това изследванията до момента са в подкрепа на спектроскопията на слъзна течност, като развиваща се област за ранна детекция, мониторинг и оценка на терапията при състояния като синдром на сухото око, глаукома, диабет и други заболявания.

Екип от България:
/Институт по електроника/

• гл. ас. д-р Александра Желязкова (Ръководител)
• гл. ас. д-р Цанислава Генова
• гл. ас. д-р Лилия Ангелова
• физик Виктория Мирчева

Работен пакет 1:

Подбор и събиране на образци. Изготвяне на протокол за изследване на слъзна течност.

Цел: Набавяне на експериментални образци „симулирани сълзи“, разтвори които имитират съдържанието на човешка слъзна течност. Изготвяне на стандартизирани протоколи за събирането на слъзна течност от доброволци при строго контролирани условия, с цел минимизиране на външни влияния и осигуряване на възпроизводомост на резултатите. Събирането, селекцията и класификацията на образци от пациенти с различни патологии ще бъдат координирани с партньори по COST акцията, при спазване на етични и реголаторни изисквания. Паралелно ще бъде извършено систематично обзорно литературно проучване с цел разработване на валидирани протоколи за провеждане на спектрални и микроскопски изследвания на слъзна течност. Особено внимание ще се отдели на индентифицирането на чувствителни подходи за детекция на биомаркери, свързани с очни и ситемни заболявания.

Работен пакет 2:

Подготовка на експерименталната установка и образците за спектроскопски измервания.

Цел: Подбраните образци ще бъдат старателно подготвени в съответствие с утвърдени стандарти и разработените протоколи, с цел минимализиране на риска от контаминация и ограничаване на артефакти, свързани с подготовката на пробите. Ще бъдат приложени контролирани процедури за съхранение и манипулация, гарантиращи стабилността на физикохимичните им характеристики до момента на анализ.

Ще бъдат подготвени експериментални установки за планираните спектрални измервания, чиято функционалност ще бъде тествана.

Ще бъде извършено прецезирано калибриране, верификация, оптимизация и подготовка на експерименталните установки за спектроскопски и микроскопски измервания. Първоначалните измервания ще подпомогнат идентифициране на ключови параметри при измерване и потенциални източници на системни грешки, като по този начин ще бъде разработен детайлен и възпроизводим протокол. Ще бъдат установени оптимални параметри за последващите спектрални и микроскопски измервания.

Работен пакет 3:

Автофлуоресцентни измервания на всички образци от слъзна течност.

Цел: Автофлуоресцентните измервания ще се извършват при строго контролирани и постоянни условия на възбуждане и регистриране на флуоресцентния сигнал, с цел оптимизиране на съотношението сигнал/шум и минимизиране на фоновите и нежеланите ефекти. Ще бъдат записани флуоресцентни матрици в подходящ спектрален диапазон, съобразен със спектралните характеристики на основните флуорофори в слъзната течност. Данните ще бъдат подложени на последващ спектрален анализ за оценка на интензитетите, максимумите и формата на спектрите, както и за откриване на значими различия между отделните образци.

Работен пакет 4:

Раманови измервания на всички образци от слъзна течност.

Цел: Рамановите измервания ще се извършват при внимателно подбрани параметри на вълната на възбуждане, съобразена с минимизиране на фоновия сигнал и оптимизиране на интензитета на спектрите. Експериментите ще се провеждат при контролирани и постоянни условия, включително оптимизация на времето на експозиция и броя на натрупваните спектри, с цел повишаване на съотношението сигнал/шум и предотвратяване на деградация на пробите. Получените спектри ще бъдат обработени и нормирани, след което ще се извърши детайлен анализ на характерните Раманови спектри за идентифициране на съставните компоненти.

Работен пакет 5:

Обработка на получените резултати и детайлен анализ.

Цел: Автофлуоресцентните спектрални данни ще бъдат получени чрез високочувствителна спектрофлуориметрична апаратура при строго контролирани и възпроизводими условия на възбуждане и излъчване, с цел оптимизиране на съотношението и минимизиране на фоновите влияния. Ще бъдат записани флуоресцентни матрици в подходящ спектрален диапазон, съобразен с характерните флуорофори в слъзната течност. Рамановите измервания ще се извършват при оптимизиран избор на дължина на вълната на възбуждане, както и контрол на параметри като време на експозиция и брой натрупвания, с цел повишаване на качеството на спектрите и предотвратяване на деградация на пробите. Получените спектри ще бъдат подложени на предварителна обработка и последващ анализ за идентифициране на характерни спектрални особенности. Микроскопските изображения ще се получават след прецизна пробоподготовка при контролирани условия, гарантиращи запазване на естествената морфология. Данните от изображенията ще бъдат обработени чрез специализиран софтуер, включващ сегментация, извличане на морфологични дескриптори и анализ на текстурни характеристики. Накрая ще се приложат сравнителни и статистически методи за интегриран анализ на спектралните и морфологичните данни с цел откриване на диагностично значими биомаркери.

Работен пакет 6:

Получаване на микроскопски изображения на слъзна течност. Анализ на микроскопските изображения.

Цел: Подготовката на пробите и получаването на микроскопските изображения ще се осъществяват при строго контролирани условия с цел запазване на естествената морфология и пространствено разпределение на компонентите. Ще бъдат използвани подходящи техники за пробоподготовка, включително контрол на температурата, влажността и начина на нанасяне на пробата върху подложката. Изображенията ще се регистрират с оптимизирани параметри на микроскопиране (увеличение, осветление, контраст), съобразени с типа на пробата. Получените данни ще бъдат обработени чрез специализиран софтуер за анализ на изображения, включително сегментация, извличане на морфологични дескриптори и оценка на текстурни характеристики. Ще се прилагат количествени методи за оценка на размер, форма и разпределение на наблюдаваните структури, както и статистически подходи за сравнение между различни образци.

Работен пакет 7:

Статистическа оценка на чувствителност и специфичност за диагностични цели базирана на оптимизирания набор от значими биомаркери за детектиране на различни заболявания.

Цел: Статистическата обработка ще включва прилагане на подходящи методи за оценка на диагностичната точност, като анализ на чувствителност, специфичност и диагностична точност. Данните ще бъдат предварително нормирани и класифицирани. Ще се използват както едновариантни, така и многовариантни статистически подходи за оценка на значимостта на избраните биомаркери. Ще бъде извършено валидиране на моделите чрез подходящи техники. Резултатите ще бъдат интерпретирани с оглед определяне на оптимални диагностични прагове и оценка на приложимостта им за детектиране на различни заболявания.

https://www.cost.eu/actions/CA24112/
https://www.tear-precision.eu